Introducción: La resistencia a los antimicrobianos por patógenos Gram negativos nosocomiales es considerada hoy como un grave problema para la salud humana. Los mecanismos de resistencia utilizados por estas bacterias están en constante evolución. Objetivos: Se monitoreó la resistencia frente a 21 antimicrobianos de 201 aislamientos de Klebsiella spp. y 284 de Acinetobacter spp. recibidas en el Laboratorio Nacional de Referencia del IPK como parte de la vigilancia realizada para estos patógenos en el período 2013-2014.  Materiales y Métodos: Se determinó la susceptibilidad antimicrobiana por la técnica de difusión en disco y el método E- test y la producción de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), AmpC y metalo-β-lactamasas mediante métodos fenotípicos. Resultados: Se detectó un porcentaje elevado de resistencia a las cefalosporinas en  Acinetobacter spp. (78,7-88,6%) y Klebsiella spp (54,7-75%) siendo esta más sensible al  cefoxitin (8,7%). La resistencia a las quinolonas osciló entre 19,0-21,5% para Klebsiella spp. y 37,5-77,3% en Acinetobacter spp. Para los aminoglucósidos, se obtuvieron valores de 13,1-45,2% en Klebsiella y 74,2-78% en Acinetobacter. La mayor susceptibilidad in vitro se observó para las polimixinas en ambos géneros bacterianos  (0,5-2%) y para los carbapenémicos en Klebsiella spp con 0,5%. pues un 63% de Acinetobacter spp resultaron resistente a meropenem. El 51% de los aislamientos de Klebsiella spp fueron productores de BLEE, mientras que ninguno produjo AmpC. El 9,5% de aislamientos de Acinetobacter fue fenotípicamente positivo para la producción de metalo-β-lactamasas. Conclusiones: La resistencia antimicrobiana en los géneros Klebsiella y Acinetobacter continúa siendo un problema en hospitales del país. La variabilidad de mecanismos de resistencia, como BLEE y metalo-β-lactamasas, impone una vigilancia continua de estos patógenos nosocomiales.